Ateliers
1 - Méthode de standardisation des cytomètres pour la réalisation d’études longitudinales
Durée de l’atelier : 3h
Pierre Grenot (Marseille) et Lillia Hadjem (Marseille)
La standardisation a pour but de produire des résultats fiables et reproductibles au cours du temps. En neutralisant la variabilité de sensibilité des instruments à chaque acquisition, la standardisation du cytomètre va permettre de réduire les écarts de mesure entre les expériences et ainsi comparer de manière plus fine les résultats au cours du temps (pourcentage, moyenne de fluorescence...). Cette méthodologie de standardisation peut être utilisée pour transposer des réglages d'un instrument à un autre et permettre ainsi la comparaison des résultats obtenus sur deux machines différentes.
2 - Kaluza™
Durée de l’atelier : 1h30
Peggy Sanatine (Évry) et Éric Bailly (Roissy CDG)
Depuis quelques années, la cytométrie en flux a connu une forte évolution technologique à la fois au niveau des cytomètres mais aussi de la variété des fluorochromes disponibles. Le type d’analyse s’est complexifié rendant les données plus difficiles à analyser et à interpréter.
De nouveaux logiciels permettent de prendre en compte ces nouveaux éléments tels qu’un nombre élevé de cellules analysées (plusieurs millions) et d’un nombre élevés de paramètres traités (analyses multicouleurs). L’arrivée de ces nouveaux logiciels sur le marché a ainsi permis de passer plusieurs caps importants dans le retraitement de ces données complexes : la rapidité du traitement de l’information ainsi que la simplification de la visualisation multiparamétrique pour une meilleure interprétation des résultats.
Le logiciel Kaluza™, de Beckman Coulter, permet l’analyse des données de cytométrie à l’aide d’outils simples et intuitifs d’utilisation. Ces outils avancés permettant une analyse multiparamétrique « simplifiée ».
Kaluza™ intègre aussi les outils indispensables comme l’automatisation des calculs de la compensation de fluorescences à l’aide d’algorithmes, la fonction Merge (fusion) des données.
L’objectif de cet atelier sera de découvrir ce logiciel ainsi que ses principales fonctions à partir de datas provenant de multiples cytomètres.
3 - Spice, mode d'emploi - de la mise en forme à l'interprétation des données statistiques
Durée de l’atelier : 3h
Après un passage bref par flow jo pour le formatage et l'export des statistiques, nous vous montrerons comment paramétrer les données (variables, fusionner différentes tables..) sur Pestle, les opérations de calcul possibles (soustraction du bruit de fond, iMFI, ajouter une variable) avant de passer sur Spice. A l'aide d'exemples précis, nous nous intéresserons aux différentes visualisations possibles, et les statistiques.
4 - Cytobank: a multidimensional data and metadata analysis system
Durée de l’atelier : 1h30
Antonio Cosma (Fontenay-aux-Roses) et Jamila Younes (Fontenay-aux-Roses)
Cytobank represent an innovative software solution for the analysis of flow cytometry data. Actually used for the analysis of mass cytometry data, it is a valuable tool for conventional flow cytometry and the analysis of massive data-sets. The software extend the multidimensional capabilities from the parameters to the metadata creating a complete analysis environment. In the present training, we will present the basis of the software and the more advanced function (SPADE and viSNE). A short introduction on how to integrate Cytobank in a more complex analysis pipeline will also be presented (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26198873). The main idea of the course is to provide participants the information to readily use the software. A 30 days free trial will be offered to all participants.
5 - Infinicyt : des outils nouveaux et uniques pour une analyse approfondie des marquages multicouleurs
Durée de l’atelier : 1h30
Nicolas Bailly (Yvoir, Belgique) et Olivier Muñoz (Rungis)
Il sera présenté l’intérêt d’utiliser Infinicyt comme un logiciel capable de décupler les performances d’analyse pour les marquages multicouleurs, et d’accéder à la création de bases de données fondées sur les profils de fluorescence des populations cellulaires. Des fonctions uniques qui seront présentées font de ce logiciel une aide précieuse pour le diagnostic ou l’exploitation de résultats complexes de cytométrie multicouleur, dans un contexte Clinique ou Recherche, respectivement.
6 - Analyse multiparamétrique et tests d’activité cellulaire : aller plus loin dans l’étude de vos sous-populations
How-to : Analyser la prolifération de sous-populations d’intérêts
Durée de l’atelier : 3h
Emmanuelle Maillard (Paris) et Emeric Deruy (Lille)
Lors de cet atelier pratique, vous apprendrez à maitriser l’analyse multiparamétrique. Vous irez plus loin que la simple recherche de sous-populations d’intérêts en y incluant des tests d’activités cellulaires.
Au travers d’un phénotypage classique de populations lymphocytaires de PBMC (CD45/CD3/CD4/CD8), vous analyserez l’activité proliférative des différentes sous-populations immunitaires en réponse à des traitements pro- et antiprolifératifs. La croissance cellulaire sera suivie par l’utilisation du Click-iT Edu (solution alternative au test classique BrdU - life technologies) et du Cell-Trace Violet (CTV - Life technologies). Le Click-iT Edu rendra compte du cycle cellulaire et de la synthèse d’ADN ; le CTV énumérera la genèse de populations filles.
Après une introduction théorique des objectifs et protocoles utilisés, les participants réaliseront ces tests sur le NovoCyte (ACEA Biosciences Inc. www.aceabio.com) ; de l’acquisition à l’analyse des données. En marge de cet atelier, nous vous proposerons également de découvrir une solution alternative innovante de mesure de la prolifération « label free » en cytométrie par impédance au travers de la technologie xCELLigence (ACEA Biosciences Inc. www.aceabio.com).
7 - Cycle cellulaire
Durée de l’atelier : 3h
Jean-François Mayol (Genève, Suisse)
Le cycle cellulaire est un processus essentiel pour le maintien de l’homéostasie tissulaire. Sa dérégulation est à l’origine de phénomènes de prolifération incontrôlée débouchant sur des pathologies tumorales. D’autre part certains agents anti-cancéreux ont pour objectif de perturber volontairement le cycle cellulaire des cellules tumorales afin de limiter leur prolifération et éventuellement les orienter vers des processus de mort cellulaire.
La cytométrie en flux est depuis de nombreuses années une méthode de choix pour évaluer la répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. L’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux est basée sur la mesure du contenu en ADN des cellules après marquage stœchiométrique par une sonde fluorescente. Ainsi, il est possible d’obtenir un histogramme monoparamétrique représentant les différentes phases du cycle : G0/G1, S et G2/M.
La principale difficulté dans l’analyse du cycle cellulaire est d’obtenir une bonne discrimination des différents pics de populations cellulaires présentes ces différentes phases du cycle. Différentes méthodologies existent : méthode des miroirs, déconvolutions logicielles. Mais une analyse rigoureuse passera tout d’abord par une préparation minutieuse des échantillons et des conditions d’analyse de qualité, c’est à dire réunir toutes les conditions qui permettent d’avoir des coefficients de variations des pics de fluorescence qui soient les plus faibles possible.
Lors de cet atelier, destiné à des personnes qui souhaitent découvrir le B-A-BA de l’analyse du cycle cellulaire, il y aura :
- une partie théorique portant sur la description des fluorochromes et des techniques analytiques,
- une partie pratique portant sur l’analyse de marquages mono-paramétriques et bi-paramétriques du cycle cellulaire sur un instrument,
- des travaux dirigés avec l’analyse de fichiers de cytométrie et leur interprétation.
Chacune de ces partie a pour objectif de donner au participant les éléments clés permettant de faire une analyse du cycle cellulaire dans des conditions les plus rigoureuse possible.
8 - Stratégie d’analyse de la qualité des panels multi-couleurs
Durée de l’atelier : 1h30
Cyril Wilmes (Rungis) et Muriel Andrieu (Paris)
Analyse des données enregistrées sur un LSRFortessa™ X20 5 lasers capable d’enregistrer 18 Couleurs simultanément. L’objectif est d’apprécier la qualité de panels 11 couleurs dédiés à l’analyse des populations lymphocytaires-T.
Pour cela vous aurez à votre disposition les contrôles indispensables : les mono-marquages, les FMOs, les cellules non marquées ainsi que les multi-marquages complets.
9 - Optimisation des protocoles de marquage intracellulaire
Durée de l’atelier : 1h30
Nicolas Zucchini (Rungis) et Muriel Andrieu (Paris)
L’objectif est de définir le protocole de marquage adapté pour l’analyse d’un panel 13 couleurs contenant notamment plusieurs cibles intracellulaires phosphorylées. Vous aurez à définir les conditions de stimulations, le tampon optimal à utiliser, la séquence de travail, éventuellement des réajustement de panels selon la stratégie choisie…
Pour cela vous aurez à votre disposition de multiples ressources permettant d’anticiper les résultats obtenus avec les réactifs sélectionnés.
10 - Apoptosis: It’s not all about Annexin V!
Durée de l’atelier : 1h30
Catherine Blanc (Paris), Stéphane Cardon (Courtaboeuf) et Matthew Shallice (Courtaboeuf)
L’apoptose ou mort cellulaire programmée est un processus normal du développement qui se déroule en plusieurs étapes. Cet atelier énoncera les techniques de cytométrie identifiant les différents moments du processus. It’s not all about Annexin V!
11 - Microbiologie 1 - Détection
Durée de l’atelier : 1h30
Marielle Bouix (Thiverval-Grignon), Sarrah Ghorbal (Thiverval-Grignon) et Vincent Genty (Saint-Malo)
Un des grands intérêt de la cytométrie en flux en microbiologie est le délai court de réponse par rapport à la méthode traditionnelle de culture. Par ailleurs, il est possible de rendre la détection spécifique avec des anticorps, ou de détecter une transformation génétique si le gène d'intérêt a été couplé à une protéine fluorescente (GFP).
Dans cet atelier, seront réalisés :
- un dénombrement des germes totaux sur un produit alimentaire (lait),
- une détection spécifique de levure de contamination (Brettanomyces) en présence d'une levure de fermentation (Saccharomyces) à l’aide d’un anticorps,
- une détection de bactérie exprimant un gène couplé à une GFP.
12 - Microbiologie 2 - Physiologie microbienne
Durée de l’atelier : 1h30
Marielle Bouix (Thiverval-Grignon), Sarrah Ghorbal (Thiverval-Grignon) et Vincent Genty (Saint-Malo)
En microbiologie positive (ferments, produits fermentés et biotechnologie blanche), l’état physiologique du microorganisme-outil est fondamental.
La cytométrie en flux, couplée à des marqueurs fluorescents permet de caractériser rapidement et simplement l’état cellulaire des microorganismes, ce qui permet en recherche d'optimiser les conditions du procédé en vue de le maintenir le plus actif possible, et en production industrielle, d’évaluer le bon fonctionnement du procédé et d’identifier les moments-clé. On peut ainsi évaluer la vitalité cellulaire (activité spécifique), mais aussi des paramètres membranaires comme l’intégrité, le potentiel trans-membranaire, la fluidité membranaire, la membrane conditionnant le fonctionnement cellulaire. On peut aussi mesurer le pH intracellulaire qui avec le potentiel transmembranaire joue un rôle important dans les échanges (force proton motrice).
Dans cet atelier, quelques exemples seront présentés sur des bactéries et des levures :
- l’évolution de la viabilité/mortalité au cours d’une fermentation,
- la mesure de la vitalité cellulaire,
- l’évaluation du potentiel de membrane.
13 - Cytotoxicité in vitro : tests cinétiques automatisés sur cultures cellulaires
Durée de l’atelier : 1h30
Jean-Baptiste Pénigault (Paris) et Ludivine Chapat (Lyon)
Les analyses visant à mesurer la cytotoxicité in vitro sont couramment utilisées pour identifier et classifier de nouvelles molécules en thérapies anti-cancéreuses ou pour prédire leur toxicité spécifique sur certains tissus. En général, les criblages multiplexés à haut débit (HTS) in vitro mesurent de nombreux paramètres en point final mais ne permettent pas dévaluer aisément l'activité biologique au cours du temps.
L’analyse cellulaire en temps réel permet d’imager et d’analyser automatiquement des phénotypes cellulaires dynamiques (prolifération, migration, mort cellulaires, interactions cellulaires, en mono ou co-culture) tout en maintenant des conditions de culture idéales et sans limite de temps.
Lors de cet atelier, vous découvrirez une technologie innovante automatisant à la fois la prise d’images (directement depuis l’incubateur) et leurs analyses.
Nous vous montrerons un exemple de test cinétique combinant mesure de la prolifération et suivi de la mort cellulaire. Si le temps le permet, nous offrirons aux participants de découvrir un ou plusieurs tests phénotypiques (chimio-tactisme, angiogénèse, croissance neuritique).
15 - Single-Cell genomic studies using C1 instrument (Fluidigm)
Durée de l’atelier : 1h30
Mickaël Meyrand (Les-Ulis), Jordan Moore (Villebon-Sur-Yvette) et Julien Picot (Évry)
Le système C1™ Single-Cell est un instrument complètement automatisé, qui permet grâce à l’utilisation de puces microfluidiques, l’isolation et la préparation des cellules pour des analyses génomiques à l’échelle de la cellule unique. qPCR, RNAseq, DNAseq, épigénétique, mesure de l’expression des miARN sont quelques-unes des applications désormais rendues possibles à l’échelle Single-Cell avec le C1™. L’objectif de cet atelier est de faire découvrir les différentes applications possibles aujourd’hui en Single-Cell, et de comprendre les différentes étapes, depuis la préparation des échantillons jusqu’à l’analyse informatique des données générées.
Le programme envisagé est le suivant :
- Présentation « Pourquoi faire du Single-Cell ? ».
- Les différents programmes et applications aujourd’hui disponibles, de l’expression génique à l’épigénétique Single-Cell. Les puces et réactifs associés (Présentation de l’offre Fluidigm).
- Détails d’une procédure de la préparation des cellules jusqu’à la préparation de librairies NGS ou la qPCR.
- Analyse des données. Utilisation des logiciels fournis par Fluidigm (dont Singular).
- La prochaine étape en Single-Cell : Exploration en Génomique fonctionnelle à l’échelle de la cellule unique (Polaris).
16 - Cytométrie Spectrale : sensibilisation à l’analyse des données
Durée de l’atelier : 3h
Julie Cazareth (Valbonne) et Nicolas Montcuquet (Puteaux)
La cytométrie spectrale ouvre de nouvelles perspectives dans l’analyse multi-couleurs de tout échantillon biologique : combinaisons inédites de sondes, gestion de l’auto-fluorescence...
L’analyse des données repose sur la performance de l’algorithme de décomposition spectrale calculé par l’instrument, et donc de la qualité des contrôles réalisés.
La bonne compréhension du traitement des données post-acquisition est donc la clé de l’optimisation expérimentale et plus largement de la robustesse de la technique.
Lors de cet atelier, nous aborderons les points suivants :
- rappel des fondamentaux,
- familiarisation avec les données,
- identification des spectres de chaque fluorochromes,
- identification et gestion de l’auto-fluorescence,
- choix de l’algorithme de décomposition spectrale,
- points critiques.
17 - Dosage de bio-marqueurs en multiplex
Durée de l’atelier : 3h30
Karine Bailly (Paris) et Samantha Bleiman (Aix-en-Provence)
La technologie Meso Scale Discovery (MSD) permet la détection de biomarqueurs en format simplex et multiplex, en plaques 96-puits et 384-puits. Elle offre une bonne alternative aux essais LuminexT et CBA® pour étudier l’inflammation (cytokines et chimiokines), les phosphoprotéines et la signalisation intracellulaire, le cancer, les biomarqueurs vasculaires et de l’angiogénèse, le métabolisme, les maladies neurodégénératrices, etc.
Utilisant l’électrochemiluminescence, ces essais offrent une forte sensibilité et une gamme dynamique large allant jusqu’à 5 logs. Ils utilisent un petit volume d’échantillon et tolèrent bien les matrices complexes, permettant de travailler avec du serum/plasma, des surnageants cellulaires, des lysats cellulaires, des homogénats de tissus et tumeurs, de l’urine, du Lavage broncho-alvéolaire (LBA), du liquide céphalo-rachidien (LCR), etc. La sensibilité et la gamme dynamique des essais permettent de mesurer le niveau des biomarqueurs dans des échantillons sains (basal) versus malades sans avoir à faire de multiples dilutions, ce qui, combiné au multiplex, permet d’économiser du temps, de l’échantillon tout en réduisant le coût de l’essai.
Durant l’atelier, après une brève introduction à la technologie de l’électrochemiluminescence, nous apprendrons à utiliser un kit MSD cytokines multiplex. Enfin, nous réaliserons l’exploitation des données afin de tracer les gammes et calculer la concentration des échantillons.
18 - ABC cytométrie
Durée de l’atelier : 1h30
Bernard Chatelain (Yvoir, Belgique) et Nicolas Bailly (Yvoir, Belgique)
L’atelier vise à découvrir ou à revisiter les éléments essentiels de la cytométrie en flux pour établir une procédure d’analyse d’un immunophénotypage multicouleur, d’une analyse du contenu en A.D.N. entre autres.
L’anatomie et la physiologie d’un cytomètre en flux est expliquée en vue d’évaluer les performances attendues d’un cytomètre en fonction de ses caractéristiques.
L’atelier comprend la mise en place d’un protocole d’acquisition (immunophénotypage et A.D.N.), l’acquisition de données et ensuite l’analyse de ces données brutes (fichiers list mode).
Pour ce faire, dans la mise en place du protocole d’acquisition, les réglages de l’instrument sont pratiquement définis (amplification des photodétecteurs, compensation,…) de même que l’importance du choix des fluorochromes dans la qualité des mesures.
Pour l’analyse des données brutes, le choix des méthodes d’analyse (logiciels et stratégies d’analyse) est illustré sur des fichiers list mode d’immunophénotypage multicouleur et d’analyse d’A.D.N.
19 - Diagnostic et suivi des SLP-B par cytométrie en flux en pratique courante
Durée de l’atelier : 1h30
Michel Ticchionni (Nice) et Rémi Letestu (Bobigny)
Le principe de l’atelier est de présenter une approche pratique des diagnostics les plus courants en reprenant les fondamentaux de l’orientation diagnostique pour les syndromes lymphoprolifératifs B, le programme comportera :
- La présentation des panels que nous utilisons dans nos laboratoires ce qui permettra de discuter les choix des panels et des anticorps, les stratégies utilisées.
- L’illustration des cas les plus fréquemment rencontrés en pratique clinique courante (LLC, lymphome folliculaire, lymphome du manteau, MBL…).
- L’accent sera mis tout particulièrement sur l’interaction avec les participants qui seront invités s’ils le souhaitent à réaliser eux-mêmes des analyses, permettant une discussion sur le choix des fenêtres, les seuils, les pièges diagnostiques, les limites de l’interprétation et d’aborder le choix d’éventuelles combinaisons complémentaires.
20 - Diagnostic d’une Leucémie aigüe
Durée de l’atelier : 1h30
Stéphanie Mathis (Paris)
L’atelier “Leucémie aigüe” a pour objectif de faire le point sur l’utilisation de la cytometrie en flux dans le cadre du diagnostic d’une Leucémie Aigüe Myéloïde ou Lymphoblastique. Après un bref rappel théorique sur les différents marqueurs utilisés en routine et les stratégies d’analyse, cet atelier permettra l’analyse et l’interprétation de plusieurs cas cliniques.
21 - Évaluation de la maladie résiduelle phénotypique dans les leucémies aigües lymphoblastiques
Durée de l’atelier : 1h30
Ludovic Lhermitte (Paris)
La maladie résiduelle phénotypique prend une place de plus en plus importante dans le suivi des hémopathies, et notamment dans les leucémies aigües lymphoblastiques. Le but de l’atelier est d'assurer une présentation générale des spécificités et des stratégies du suivi phénotypique de la maladie résiduelle dans les LAL-B et T. Après une partie sur les données de la littérature et les principes théoriques, les participants pourront visualiser des analyses de cas pour les entraîner à l’identification de la maladie résiduelle à partir de cas réels. L’objectif est de sensibiliser les participants aux écueils et aux exigences techniques afin d'optimiser l'évaluation des évènements lymphoblastiques rares.
22 - Myléodysplasie
Durée de l’atelier : 1h30
Avoir des notions de cytométrie de base pour participer à cet atelier
Lydia Campos (Saint-Étienne) et Carmen Aanei (Saint-Étienne)
Présentation d’un petit diaporama sur l’intérêt diagnostic précoce des myélodysplasies par cytométrie en flux. Actuellement il y a une forte demande des cliniciens pour avoir un diagnostic précoce des myélodysplasies car plusieurs patients pourraient bénéficier d’un traitement avant que la maladie soit avancée. Nous montrerons les différents scores et les pages d’analyse qui permettront de détecter plusieurs anomalies phénotypiques même quand la cytologie est normale. Plusieurs cas des patients seront analysés.
24 - Myélome
Durée de l’atelier : 1h30
Nicolas Chapuis (Paris)
L’atelier “Myélome” permettra de faire le point sur l’intérêt de l’utilisation de la cytometrie en flux dans le cadre du diagnostic et du suivi d’une gammapathie monoclonale de signification indéterminée ou d’un myélome. Après un bref rappel théorique sur les différents marqueurs utilisés en routine et les stratégies d’analyse, cet atelier permettra l’analyse et l’interprétation de plusieurs cas cliniques au diagnostic mais également en situation de recherche de maladie résiduelle.
25 - HPN
Durée de l’atelier : 1h30
Bernard Drénou (Mulhouse)
27 - Dossier de validation de méthode : cytométrie en flux appliquée aux hémopathies et aux désordres de l’immunité : retour d’expérience des groupes experts FranceFlow et GEIL
Durée de l’atelier : 1h30
Françoise Durrieu (Bordeaux) et Michel Ticchioni (Nice)
L’atelier a pour objectif de faire partager l’expérience et les recommandations des groupes France Flow et GEIL pour la constitution du dossier de validation des méthodes SH-Form 43 « dépistage et caractérisation d’une hémopathie par cytométrie en flux » en vue de l’accréditation. L’atelier sera construit autour du SH-Form 43.
Les propositions des deux groupes pour compléter les différents items seront discutées et débattues avec l’ensemble des participants.
Le groupe FranceFlow réunit 19 laboratoires français et belges d’hématologie et d’immunologie spécialisés en phénotypage multicouleurs des leucémies et lymphomes. Outre la standardisation des machines, le groupe travaille depuis plusieurs années à l’harmonisation des pratiques quotidiennes dans le cadre du phénotypage des hémopathies malignes.
Le Groupe d’Etude Immunologique des Leucémies, créé en 1984, regroupe de nombreux laboratoires d’hématologie et d’immunologie français et belges et est à l’origine de très nombreuses études portant notamment sur la caractérisation immunophénotypique des leucémies et lymphomes.
28 - Imagerie en flux, de l’acquisition à l’analyse
Durée de l’atelier : 3h
Pierre Bourdoncle (Paris)
Depuis quelques années, l'imagerie en flux s’est imposée comme une vraie alternative ou tout au moins comme une technique complémentaire à la cytométrie et à la microscopie photonique. L’information spatiale couplée à de grande population permet d’accéder rapidement à des sous population ou à des variations difficilement observables par d’autre techniques.
Après un rappel théorique, l’atelier traitera de toutes les étapes clés, de l’acquisition à l’analyse des données.
29 - Principe général de la cytométrie de masse, acquisition d’échantillons et analyse multi-paramétrique de données
Durée de l’atelier : 3h
Aurélien Corneau (Paris), Hélène Gary (Clamart) et Émilie Gregori (Marseille)
La cytométrie de masse bénéficie des avantages des caractéristiques uniques de la spectrométrie de masse et les adapte à la cytométrie, elle permet d’analyser simultanément le signal provenant de plus de 40 métaux différents et plus de 100 dans le futur. L’objectif de l’atelier est de comprendre le principe général de la cytométrie de masse et de savoir réaliser des marquages sur plus de 30 biomarqueurs. L’acquisition d’échantillons marqués par des anticorps couplés aux métaux sera réalisée sur un cytomètre de masse CyTof2, l’analyse des données sera abordée avec les logiciels FlowJo et Cytobank
30 - Compréhension de la démarche qualité par la pratique
Durée de l’atelier : 1h30
Yousra Lottin (Paris)
Comprendre les principes et concepts du management de la qualité. Cet atelier vise à sensibiliser à la démarche qualité avec pour objectif une appropriation des principes de management de la qualité selon la norme ISO 9001. Les stagiaires commenceront à concevoir les premiers outils pour leur propre démarche qualité. Attention, l’atelier ne vise pas la maîtrise d’un système de management de la qualité mais la concrétisation de notions permettant d’appréhender le management de la qualité.
32 - Tri de microparticules
Durée de l’atelier : 3h
Pierre-Henri Commère (Paris), Philippe Rameau (Villejuif) et Benoît Dupont (Roissy CDG)
Les microparticules (MP) sont des vésicules extra-cellulaires qui proviennent du bourgeonnement de membranes cellulaires. Les MP peuvent constituer de potentiels biomarqueurs ou être utilisées comme voies de communication ou de transfert. Leur étude a été jusqu’à présent limitée du fait de contraintes techniques. Grace aux avancées technologiques, il est possible, notamment sur le trieur Astrios, de discriminer des particules de taille de l’ordre de 100 nm. Durant cet atelier, nous allons utiliser des billes pour faire les réglages de la machine puis trier des échantillons biologiques.
33 - Comparaison de différentes méthodes de tri de monocytes
Durée de l’atelier : 3h
Mercredi : Marie Nguyen - de Bernon (Paris) et Shahul Mouhamad (Paris)
Jeudi : Marie Nguyen - de Bernon (Paris) et Quentin Espinassous (Paris)
Durant cet atelier, les avantages et inconvénients des tris par cytométrie en flux ou par billes magnétiques seront comparées. Le choix de l’une ou l’autre technique, voire des deux successivement se fera en fonction de rareté des cellules à trier, de la pureté et/ou de la rapidité requise(s).
Dans ce but, nous trierons différentes sous-populations de monocytes (CD14+/CD16-), (CD14+/CD16+) et (CD14-/CD16+) à partir de PBMC humains.
34 - Tri microbiotes
Durée de l’atelier : 1h30
Christophe Parizot (Paris) et Carole Astruc (Marnes-la-Coquette)
Le rôle du microbiote intestinal (l’ensemble des micro-organismes - bactéries, virus, champignons non pathogènes, dits commensaux - vivant dans un environnement spécifique) est de mieux en mieux connu. On sait désormais qu’il joue un rôle dans les fonctions digestives, métaboliques, immunitaires et neurologiques. La métagénomique est l’étude du génome des microorganismes et notamment les bactéries qui habitent notre intestin et nous modulent de façon très profonde. La cytométrie en flux est un outil indispensable pour l’étude de ce microbiote et de la cartograpie métagénomique de celui-ci. Au cours de cet atelier, nous aborderons la mise en œuvre d’un tri de Procaryotes à l’aide d’un cytomètre analyseur-trieur (S3e Bio-Rad) automatisé (Démarrage, Amplitude, Drop Delay) ne nécessitant que très peu de connaissances en tri cellulaire, ainsi que du control de ce tri. Le passage extrêmement facile et rapide d’un tri de cellules Eucaryotes à un tri de Procaryotes tout en gardant la stérilité de l’appareil.
36 - Initiation à la cytométrie multicouleur
Durée de l’atelier : 3h
Nicolas Dumoitier (Paris) et Éric Butillon (Paris)
Après une présentation et des rappels sur les principes de la cytométrie et des marquage multicouleurs, la partie pratique permettra de réaliser un marquage 8 couleurs sur sang stabilisé (7 marqueurs de surface et une sonde de viabilité). Des témoins seront préparés : cellules non-marquées, simples marquages sur billes de compensation, contrôles isotypiques. Puis l'acquisition se fera sur un cytomètre MACSQuant, Réglages (voltages et compensations), Programmation de l’acquisition d’un portoir de tubes, Export des datas sur clé usb.
Une analyse post-acquisition des datas sous le logiciel FlowLogic sera ensuite réalisée.