Atelier 5
À la rencontre des vésicules extracellulaires : les décoder aujourd’hui pour révolutionner la prise en charge des patients de demain
Co-animateurs : Celia de GIRVAL (Ingénieur, Inserm 1231) & à confirmer
Contenu de l’atelier :
Cet atelier combinera théorie et pratique sur 3h30, offrant aux participants une expérience complète sur des méthodologies et technologies concernant l’isolation et la caractérisation des vésicules extracellulaires issues du plasma. Les participants apprendront comment chaque dispositif contribue à l’analyse approfondie de ces vésicules extracellulaires (VE).
Les objectifs spécifiques sont les suivants :
- 1. Introduction aux vésicules extracellulaires et leur intérêt en tant que biomarqueurs circulants :
- Définir les vésicules extracellulaires et leur rôle biologique.
- Comprendre leur intérêt dans les biopsies liquides, leur application dans le diagnostic et le suivi de certaines pathologies, notamment le cancer.
- Discussion interactive : sur les étapes critiques pour l’analyse des VE plasmatiques (importance du pré-analytique, méthodes d’enrichissement, avantages/inconvénients).
- 2. Détermination de la taille et de la concentration des VE plasmatiques :
- Comprendre le principe du suivi individuel de particules (NTA).
- Effectuer des démonstrations pratiques de l'utilisation des technologies basées sur le NTA (NS300 et Videodrop).
- Comprendre les complémentarités entre ces deux technologies.
- 3. Analyses des protéines des VE par western blot capillaire :
- Comprendre les principes et les avantages de la technologie du Western blot capillaire.
- Réaliser une expérience pratique pour identifier les protéines associées aux vésicules extracellulaires.
- 4. Manipulation du cytomètre BD FACSymphony™ A1 pour une analyse multiparamétrique des protéines des vésicules extracellulaires :
- Comprendre le fonctionnement du cytomètre en flux BD FACSymphony™ A1 et son application pour l'analyse des vésicules extracellulaires au niveau cellulaire et subcellulaire.
- Apprendre à utiliser cette technologie pour identifier, caractériser et quantifier les vésicules extracellulaires porteuses de biomarqueurs dans des échantillons de plasma, permettant ainsi des analyses approfondies dans le contexte des biopsies liquides.
- 5. Interprétation des résultats :
- Analyser les données générées par les différentes techniques (VideoDrop, NTA, Western Blot et cytométrie en flux).
- Développer des compétences pour interpréter les résultats dans le contexte des applications cliniques des vésicules extracellulaires en tant que biomarqueurs circulants, notamment pour le diagnostic, le pronostic et le suivi des patients.
Nombre de participant(e)s : 8-10 maximum.
Public concerné :
Destiné aux chercheurs et cliniciens (techniciens, ingénieurs, chercheurs et doctorants), avec ou sans expérience préalable dans les vésicules extracellulaires. Les participants travailleront sur des échantillons préparés à l’avance par les organisateurs.
Tous niveaux : de technicien à chercheur.
Pré‐requis des candidats(es) :
- Connaissances de base en biologie cellulaire et moléculaire :
- Compréhension des concepts fondamentaux liés à la biologie cellulaire, notamment la structure et la fonction des cellules, ainsi que la communication intercellulaire.
- Expérience pratique ou théorique en techniques de laboratoire :
- Avoir une expérience préalable dans l'utilisation d'outils de laboratoire de base comme les centrifugeuses, les pipettes.
- Une familiarité avec les techniques de biologie moléculaire et cellulaire comme la Western Blot et les principes généraux de la cytométrie en flux (même si une introduction à ces techniques sera incluse dans l’atelier, une compréhension préalable peut être bénéfique).
Modalités pratiques : L’atelier se déroulera en français et anglais :
Type d’instrumentations utilisées :
- Videodrop (Myriade) : Videodrop filme en temps réel dans une simple goutte les particules biologiques entre 80 nm & 500nm et fournit une image microscopique jusqu’à 10 µm. Le dispositif compact, assisté d’un logiciel dédié, rend la manipulation très facile à réaliser. Aucun marquage n’est nécessaire sur l’échantillon analysé. On peut travailler sur des solutions non purifiées et sur de petits volumes d’échantillon (5 µL) avec une gamme de concentration de 10^8 à 10^10 particules/ml.
- NS300 (Malvern) : Le NanoSight NS300 repose sur la technologie d'analyse du suivi individuel de particules (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA). Cette technologie exclusive combine les propriétés de diffusion de la lumière ou de fluorescence et du mouvement Brownien pour déterminer la distribution de tailles et la concentration des particules en suspension dans un liquide. Un faisceau laser traverse la chambre d'échantillon et les particules en suspension présentes sur la trajectoire de ce faisceau diffusent la lumière de telle sorte qu'elles peuvent être facilement visualisées avec un microscope avec un grossissement de 20x, équipé d'une caméra. La caméra fonctionne à une fréquence de 30 images par seconde, et enregistre un fichier vidéo des particules soumises au mouvement Brownien. Le logiciel repère de nombreuses particules individuellement et en calcule le diamètre hydrodynamique à l'aide de l'équation de Stokes-Einstein.
- Western blot capillaire (Biotchne) : Jess automatise la séparation des protéines et la détection immunologique du Western blot traditionnel, éliminant ainsi de nombreuses étapes fastidieuses et sujettes aux erreurs. Il vous suffit de charger vos échantillons (moins de 10 µG) et réactifs dans la microplaque, et Jess s’occupe du reste. Elle sépare vos protéines en fonction de leur taille et gère avec précision l’ajout des anticorps, les incubations, les lavages, et même les étapes de détection. 3 heures pour obtenir des résultats entièrement quantitatifs. Grâce à la détection chimiluminescence de Jess et à sa détection fluorescente de pointe, vous bénéficiez d’une sensibilité au niveau du picogramme, d’une normalisation intégrée des protéines totales, et de résultats hautement reproductibles, comparables à ceux d’un test ELISA, avec en plus une caractérisation du poids moléculaire.
- BD FACSymphony™ :
- L’analyseur de cellules BD FACSymphony™ A1 :
- Bénéficie de la technologie ultraperformante de la gamme BD FACSymphony™ pour réduire le bruit de fond et augmenter la sensibilité de détection.
- Dispose d’une électronique produisant peu de bruit, de lasers haute puissance et d’un faisceau lumineux étroit afin d'analyser jusqu’à 16 couleurs de fluorescence.
- Analyse de façon indépendante les particules de petite et de grande taille sur un seul instrument. Le détecteur optionnel de micro-particules permet la détection de petites particules (SP SSC) telles que les vésicules extracellulaires, les particules virales et plus encore.
- Est compatible avec toute la gamme des réactifs BD Horizon Brilliant™ et le logiciel BD FACSDiva™.
- Offre un format compact pour une installation sur la paillasse du laboratoire.
- L’analyseur de cellules BD FACSymphony™ A1 offre (en option) un détecteur dédié conçu pour distinguer la diffraction des petites particules telles que les vésicules extracellulaires, les particules virales, les exosomes, etc.
- Le système se compose :
- D’un laser bleu puissant de 100-mW (488 nm) pour optimiser l’excitation des particules.
- D’un faisceau lumineux de plus petite taille permettant de focaliser le trajet optique conçu pour augmenter la résolution.
- D’un pinhole et d’un filtre band-pass pour bloquer et éliminer la lumière parasite.
- D’un détecteur ultrasensible dédié au SSC (SP SSC).
- D’une détection indépendante des particules de grosse taille (SSC) et de petite taille (SP SSC) sur un seul instrument, sans avoir à modifier les paramètres de l’instrument.
- L’analyseur de cellules BD FACSymphony™ A1 :
Lieu :
UFR Sciences de Santé
Salle 356
7 boulevard Jeanne d’Arc - BP 87900 - 21079 Dijon Cedex