Atelier 3
Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux : outils, opportunités, pièges et limites
M. Quaranta (1), X. Ronot (2)
(1) LBCMCP, UMR5088 - CNRS/Université Paul Sabatier - Toulouse III - FRBT, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 9
(2) Laboratoire CaCyS, FRE 3405 UJF - CNRS-EPHE - UPMF, 38706 La Tronche Cedex (xavier.ronot@ujf-grenoble.fr)
L’étude du cycle cellulaire demeure l’une des applications majeures de la cytométrie en flux notamment pour l’analyse des perturbations induites par des xénobiotiques. Elle est fondée sur le marquage stœchiométrique de l’ADN par des fluorochromes spécifiques de nature différente. Cette étape permet l’obtention d’une distribution des cellules en fonction de leur contenu en ADN, reflet de leur position dans le cycle : G0/1, S et G2+M, sous la forme d’un histogramme monoparamétrique. L’estimation des effectifs dans les différentes phases dépend de la méthode employée (miroir, gaussiennes,….) mais également du coefficient de variation des pics G0/1 et G2+M. Le recours à l’élimination des doublets et agrégats cellulaires au moyen des paramètres du signal de fluorescence ne dispense pas d’une bonne qualité de préparation des suspensions cellulaires.
Une analyse monoparamétrique du cycle cellulaire n’a pas la capacité de discriminer les cellules en début et en fin de phase S, des cellules en G0/1 et G2+M. L’analyse biparamétrique permet d’obtenir des informations complémentaires sur le cycle cellulaire; elle consiste à combiner cette mesure du contenu en ADN avec différents paramètres caractéristiques de la réplication (BromodésoxyUridine ou EdU), ou de la présence de protéines particulières, directement associées ou non au phénomène prolifératif (antigène Ki67, histone H3 phosphorylée, épitope MPM2 (Mitotic phosphoprotein 2), PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), cyclines,…). Même si la cytométrie en flux est capable de détecter des cellules dont le contenu en ADN est supérieur à 4N, la quantification des cellules binucléées en G0/1 demeure impossible par les techniques classiques.
Cet atelier comprendra plusieurs parties :
- Des informations théoriques sur l’utilisation des fluorochromes, la préparation des cellules et la méthodologie permettant l’interprétation du cycle cellulaire pour une analyse mono ou multiparamétrique afin d’affiner la distinction des différentes phases entre elles.
- La mesure du contenu en ADN via l’acquisition d’échantillons simplement ou doublement marqués au moyen de cytomètres.
- Des travaux tutorés interactifs contenant différentes situations expérimentales destinées à évoquer les bonnes pratiques, les limites et les pièges rencontrés.
Références :
- Critical aspects in analysis of cellular DNA content. Darzynkiewicz Z. Curr Protoc Cytom. 2010, Chapter 7: Unit7.2.
- Cytométrie en flux et cycle cellulaire. D. Grunwald, J.F Mayol & X. Ronot (eds) Tec & Lavoisier, Paris, 2010.